大腸埃希桿菌性胃腸炎

大腸埃希桿菌性胃腸炎 的檢查：

血清鈉（Na+,Na） 血清鉀(K+,K) 血常規 肛門拭子檢查法

1.采集標本 以無菌棉拭子蘸取腹瀉病患者糞便，如無糞便，以浸濕磷酸鹽緩沖液的直腸拭子插入肛門4～6cm(嬰幼兒2～3cm)處，在直腸內旋轉擦取直腸表面黏液后取出，盛于運送或保存液中，如不能及時送檢，樣品應在4℃冷藏保存，但以不超過8h為宜。
2.增菌和分離培養 對于大腸埃希桿菌的分離應在初代分離時選用弱選擇性培養基，如伊紅亞甲藍、中國藍薔薇酸式山梨醇麥康凱平板。劃線分離，35～37℃培養18～24h后，觀察菌落形態特征，選取紫紅色或暗紅色、大小1～3mm、邊緣整齊有光澤、中央凸起的單個菌落進行鑒定。
3.鑒定
(1)初步鑒定：根據菌落特征、涂片染色的菌形及染色反應，取純培養物細菌作生化反應，凡符合所示結果可初步鑒定為大腸埃希桿菌。
(2)最后鑒定：一般常規檢驗做到上述初步鑒定即可，必要時可按《伯杰系統細菌學手冊》所列生化反應做出最后鑒定，其中主要的鑒定試驗為：觸酶陽性，氧化酶陰性;發酵葡萄糖產酸產氣或只產酸，發酵乳糖產酸產氣或遲緩發酵產酸，不發酵肌醇;IMVC反應分別為 ， ，-，-(占94.6%);脲酶陰性，H2S陰性，苯丙氨酸脫氨酶陰性，硝酸鹽還原陽性，動力多數陽性。簡便的方法是采用腸桿菌科試劑盒，根據反應結果編碼后做出最后鑒定。
(3)鑒定試驗：某些大腸埃希桿菌，尤其是無動力的不發酵乳精株，應與志賀菌相鑒別，二者的主要鑒別試驗可用醋酸鈉和葡萄糖銨利用試驗及黏質酸鹽產酸3種試驗。大腸埃希桿菌均為陽性，而志賀菌為陰性。
①致病性大腸埃希桿菌：
A.假定試驗：于鑒別平板上菌落生長稠密處挑取培養物，以EPEC的3種多價O血清作玻片凝集試驗。如與某一種多價O血清凝集，再與該多價血清所包含的O單價血清做試驗。如與某個O單價血清凝集，再挑取3～5個單個菌落，與該血清作凝集試驗。
B.生化試驗：選擇O單價血清強凝集的菌落接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質試紙片，經36℃培養18～20h。凡是乳糖、蔗糖產酸，葡萄糖產酸并多數產氣，H2S陰性，靛基質陽性的菌株，可證實為大腸埃希桿菌。如果靛基質為陰性時，還必須V-P試驗為陰性，且不能在西蒙枸櫞酸鹽瓊脂上生長，方可證實為大腸埃希桿菌。
C.血清學證實試驗：刮取三糖鐵瓊脂上的培養物，用生理鹽水制成菌懸液，稀釋至與MacFarland 3號比濁管相當的濃度。0單價血清如果原效價在1∶(160～320)，則可l∶40稀釋(用0.5%鹽水)。在10mm×75mm試管內，將稀釋的抗血清與菌懸液等量混合，于50.6℃水溫中16h后觀察結果。如果出現凝集，可證實為該O因子。
②出血性大腸埃希桿菌：已知為出血性腸炎患者的糞便，可劃線接種以山梨醇代替乳糖的麥康凱瓊脂平板。經培養后，挑選3～5個山梨醇不發酵的菌落，以O157血清(最好同時再以H7血清)作玻片凝集試驗和單管凝集試驗以確定診斷。
分離的菌株應接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質試紙片，經36℃培養18～20h。典型的生化特性為乳糖、蔗糖產酸，葡萄糖產酸產氣，H2S陰性，靛基質陽性。并接種山梨醇發酵管，為遲緩發酵。
③毒性大腸埃希桿菌：
A.生化試驗：于鑒別平板上挑取可凝菌落5個，一般挑取乳糖發酵的典型菌落，分別接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質試紙片，經36℃培養18～20h。凡是乳糖、蔗糖產酸，葡萄糖產酸并多產氣，H2S陰性，靛基質陽性的菌株，可證實為大腸埃希桿菌。如果靛基質為陰性時，還必須V-P試驗陰性，且不能在西蒙枸櫞酸鹽瓊脂上生長，方可證實為大腸埃希桿菌。
B.腸毒素試驗：產毒性大腸埃希桿菌主要靠腸毒素試驗證實。腸毒素試驗的方法甚多，國內目前以雙相瓊脂擴散試驗測定LT，以乳鼠灌胃試驗測定ST，有時亦采用家兔結扎回腸段試驗以測定LT和ST。
當前已有采用基因診斷法測定這兩種腸毒素。
a.雙向瓊脂擴散試驗：將被檢菌株按5點環形接種于Elek培養基上，以同樣操作，共做兩份，于36℃培養48h。在每株菌的菌苔上放一片多黏菌素B紙片，于36℃經5～6h，使腸毒素滲入瓊脂中。在離菌苔各5mm處的中央，挖一個直徑4mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在孔內滴加LT抗毒素30μl，并用已知產LT和不產毒菌株作對照。于36℃培養15～20h觀察結果。在菌斑和抗毒素孔之間出現白色沉淀帶者為陽性，否則為陰性。
b.乳鼠灌胃試驗：將被檢菌株接種于Honda產毒肉湯內，于36℃培養24h，3000r/min離心30min，取上清液經薄膜濾器過濾，60℃加熱30min，每毫升濾液內加入2%伊文思藍溶液0.02ml。將此濾液用塑料小管注入1～4天齡的乳鼠胃內0.1ml，同時接種3～4只。禁食3～4h后用氯仿麻醉，取出全部腸管，稱量腸管(包括積液)重量及剩余的體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽性，0.07～0.09為可疑。
c.家兔結扎回腸段試驗：將被檢菌株接種于Honda產毒肉湯，于36℃培養24h，3000r/min離心30min，取上清液經薄膜濾器過濾。濾液分成兩份，一份不加熱，供測LT用;另一份60℃加熱30min，供測ST用。取體重2kg家兔，禁食1天。麻醉后剖腹，取出回腸段，按10～15cm為一段，分段結扎。取一段注射肉湯2ml作為陰性對照，另一段注射已知產毒菌肉湯培養物的濾液2ml作為陽性對照。其他各段分別注射待試菌株肉湯培養物的濾液2ml，將腹壁縫合。測定ST時，于注射后6～8h剖腹檢查;測定LT時，于注射后18h剖腹檢查。抽取各腸段內的濾液，測定其容量，并測定腸段的長度。積液量(ml)與腸段長度(cm)之比大于1為陽性。
d.血清學試驗：腸毒素試驗陽性菌株可用ETEC有關的多價O血清及單價血清作玻片凝集試驗，以確定其O抗原。
④侵襲性大腸埃希桿菌：
A.生化試驗：于鑒別平板上挑取菌落3～5個，一般應多挑取與志賀菌相似的不發酵乳糖的菌落，但發酵乳糖的優勢菌落亦可適當挑取。將挑取的菌落接種半固體管，36℃培養18～24h。有動力的菌株一般可以棄去，除非經血清學鑒定為0124。留下無動力的菌株，接種三糖鐵瓊脂，懸掛靛基質試紙片，36℃培養18～20h。同時并作賴氨酸脫羧酶試驗。EIEC的典型生化特性為：乳糖、蔗糖不產酸或產酸，葡萄糖產酸、產氣或不產氣，H2S陰性，靛基質陽性，賴氨酸脫羧酶陰性，除O124外均無動力。賴氨酸脫羧酸試驗亦可以放在血清學試驗以后做。
B.血清學試驗：挑取三糖鐵瓊脂培養物，用EIEC的兩個多價O血清作玻片凝集試驗，以確定其O抗原的成分。
C.豚鼠角膜試驗：將菌液滴入豚鼠眼內2～5天內觀察是否有紅腫、流淚、充血癥狀。
D.ELISA試驗：用已知EIEC或志賀菌屬的有毒菌株免疫家兔，所得之免疫血清用同型的無毒菌株吸收。用ELISA法測定，EIEC各型的有毒菌株及志賀菌屬各型的有毒菌株均為陽性。此法系檢測被檢菌的侵襲性多肽，亦可采用基因探針法檢測。
⑤集聚性大腸埃希桿菌：集聚性大腸埃希桿菌(EAEC)的重要特征是在Hap-2細胞周圍形成特征性的集聚性黏附。Yamamoto發現在37℃培養時，EAEC的此種聚集性黏附可發生在某些液體培養基的生長表面，形成很厚的黏附聚集性菌塊。在25℃或42℃則無此現象，液體培養基以L或M-H培養基最佳，以此可作為EAEC的初步鑒定手段。液體培養基中菌塊形成試驗：大腸埃希桿菌接種于M-H液體培養基(Difco)，35～37℃溫育18～24h，凡表面(部分下沉管底)形成菌塊者為陽性，均勻混濁無菌塊者為陰性。1996年王梅等對腸道凝聚性-黏附性大腸埃希桿菌進行簡易篩查試驗，將M-H培養基上的菌塊形成試驗與Hep-2細胞黏附試驗進行對比，發現兩者的一致率達77%，如包括彌散型和局限型在內則達88.5%。表明菌塊形成試驗是可靠的初步篩查EAggEC的方法。
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