厭氧菌的分離與鑒定

厭氧菌的分離與鑒定概述

厭氧菌的分離與鑒定是對氧敏感度高的細菌進行分離與鑒別的試驗，因為厭氧微生物在自然界分布廣泛，種類繁多，其生理作用日益受到人們的重視。專性厭氧菌，對氧氣非常敏感，因此，他們的分離、培養及活菌計數的關鍵是提供無氧和低氧化還原電勢的培養環境。 

• 檢查部位 其他
• 科室 內科體檢、保健科
• 相關疾病
• 相關癥狀 糖尿病皮膚病變

厭氧菌的分離與鑒定正常值

• 體內菌群的種類和比例正常，人體處于動態平衡健康狀態。 

厭氧菌的分離與鑒定臨床意義

• 下面主要介紹的是一種簡便的試管培養法——亨蓋特厭氧滾管技術，亨蓋特厭氧滾管技術是美國微生物學家亨蓋特于1950年首次提出并應用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養技術。
  異常結果：由厭氧梭狀芽胞桿菌所致的特殊病癥如氣性壞疽、破傷風、肉毒中毒等。
  需要檢查的人群：有糖尿病，嚴重肝病，肝硬化，尿毒癥，褥瘡潰瘍，肢體壞疽，肉毒中毒等癥狀的患者。 

厭氧菌的分離與鑒定檢查方法

• 分離
  (1)編號
  取五支無菌水試管，分別用記號筆標明10-1、10-2……10-5。
  (2)稀釋
  在無氧無菌的超凈厭氧手套箱中的條件下，用無菌注射器吸取1mL混合均勻的液體樣品，加入裝有預還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其混合均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1mL10-1稀釋液至另一裝有9mL生理鹽水的厭氧試管中，制成10-2稀釋液。依此進行10倍系列稀釋，至10-6，制成不同樣品稀釋液。通常選10-4、10-5、10-6三個稀釋度進行滾管計數。
  (3)滾管分離
  1)滾管
  將無氧無菌的瓊脂培養基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒溫的水浴中，待用，當培養基從瓶中取出時，要用N2在培養基內中充氣。再在試管中用N2充氣，趕走所有管內空氣，然后把培養基加入管內，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管內，及時拔出充氣針頭。用無菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三個稀釋度各0 .1mL，分別注入待用的試管中，然后將其平放于盛有冰水的瓷盤中迅速滾動，帶菌的溶化瓊脂在試管內壁會即刻形成凝固層。
  2)分離純化
  生成的菌落需挑取出來，鏡檢其形態及純度。如尚未獲得純培養物，需再次稀釋滾管，并再次挑取菌落，直至獲得純培養物為止。待挑取的單菌落預先在放大鏡下觀察確定，做好標記。然后將培養基試管固定于適當的支架上，打開試管膠塞，同時迅速將氣流適當、火焰滅過菌的氮氣長針頭插入管內。同時，另一液體厭氧管去掉膠塞插入另一滅過菌的通氣針頭。將準備好的彎頭毛細管小心插入固體培養基內，找準待挑菌落，輕輕吸取，轉移至液體試管內，加塞。37℃培養，培養24h或更長時間或待培養液混濁后檢查已分離培養物的純度。
  3)劃線分離
  將試管橡皮塞的一端在火焰上灼燒一下，挨著打氣針塞住管口，在針頭快速取下前，通氣15-20s，管口一端在火焰上燒片刻。旋緊管塞，劃線后的卷管直立保溫，使用CO2：H2=80：20，因為CO2比空氣重，開啟后管塞不致有空氣殘留。劃線后的滾管，置34-37度下培養，便可長出菌落。
  菌種的鑒定
  1.糖發酵試驗
  糖發酵實驗是最常用的生化反應，在腸道細菌鑒定上尤為重要。絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖的能力上有很大差異，有些細菌能分解糖并產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣;傷寒桿菌能分解葡萄糖產酸不產氣，不能分解乳糖;普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，不能分解乳糖。酸的產生可以利用指示劑來斷定。在配制培養基時預先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)—6.8(紫色)]，當發酵產酸時，可使培養基由紫色變為黃色。氣體的產生可由發酵管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。
  具體實驗步驟：
  ① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
  ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
  ③ 24h后觀察各管中液體顏色變化及產氣情況。
  2.蛋白質分解實驗
  ① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
  ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
  ③24h后各管分別進行米倫氏反應、吲哚反應、黃色反應和坂口反應等。
  3.淀粉水解實驗
  ① 將菌液進行適當稀釋，之后在無菌環境下，取一定量的稀釋液注入生化鑒定管中，用無菌封口膜封口。
  ② 將接種后的鑒定管放入厭氧罐中，充足氮氣后放入37℃恒溫培養箱培養。
  ③ 24h后于各管中加入適量盧戈氏碘液觀察淀粉的水解情況。 

厭氧菌的分離與鑒定注意事項

• 在進行厭氧菌分離鑒定的過程中，需注意下述事項。
  (1)厭氧標本在采集和運輸的過程中必須與空氣隔絕，務必在30min內完成，同時應避免正常菌群的污染。
  (2)培養基要新鮮配制，若儲存太久，有氧氣溶解在表面或有過氧化物在培養基中，不利于厭氧菌生長。
  (3)若菌落太小，需用放大鏡觀察菌落。
  (4)做耐氧試驗，要求從每個瓊脂平板上挑取4～5個性狀不同的菌落，分別接種需氧和厭氧血瓊脂平板，置于需氧、二氧化碳和厭氧環境中培養。
  (5)如做胞外酶鑒定，一定要有足夠的菌液濃度。